γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的化學(xué)性質(zhì)分析
隨著研究的深入，人們對γ-GTP的催化功能和分子結(jié)構(gòu)有了更多的了解，并發(fā)現(xiàn)其在臨床上可作為肝膽疾病的生物標(biāo)志，被廣泛應(yīng)用于肝病及其他臟器疾病的診斷和預(yù)后檢測[3-4] 。近年來，由于生物技術(shù)發(fā)展突飛猛進(jìn)，生物催化與生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)中逐漸興起，利用γ-GTP制備系列γ-谷氨�；惢衔锏难芯恳殉蔀樯锎呋I(lǐng)域的熱點。已有報道利用γ-谷氨�；é�-glutamylization）反應(yīng)合成了GG-DOPA等多種化合物[5-7]。地衣芽孢桿菌所產(chǎn)生的γ-GTP在25~35 ℃的溫度范圍有較好的穩(wěn)定性，在50 ℃的溫度下保存20 min酶活力基本喪失，這為進(jìn)一步利用該酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸時的溫度條件提供了依據(jù)。該酶對酸性環(huán)境無耐受性，適宜在堿性條件下保存，在pH低于11的堿性條件下保存30 min，酶活力基本無損失。利用γ-GTP生產(chǎn)茶氨酸需要反應(yīng)體系pH 為10[9]，而該酶在此pH下比較穩(wěn)定，說明地衣芽孢桿菌所產(chǎn)生的 γ-GTP適合于酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸。
1材料與方法
1.1主要材料與試劑
菌種：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）由本實驗室篩選獲得。試劑：Tris 購自北京普博欣生物公司；L-γ-谷氨酰對硝基苯胺、雙甘肽均購自廣州威佳科技有限公司；硫酸銨為國產(chǎn)分析純。
1.2地衣芽孢桿菌的產(chǎn)酶發(fā)酵
用接種環(huán)在活化好的.菌種斜面上刮下一環(huán)菌種，將其轉(zhuǎn)入到種子培養(yǎng)基，30 ℃、240 r/min搖床振蕩培養(yǎng)16 h。以20%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基（30 mL發(fā)酵液/300 mL三角瓶）中，在30 ℃下240 r/min搖床培養(yǎng)28 h后收集菌體。
1.3γ-GTP粗酶的制備
γ-GTP發(fā)酵瓶培養(yǎng)液離心（4 800 r/min,10 min），棄上清液，用TE緩沖液（Tri-HCl 緩沖液，pH 8.0，10 mol/L）重懸菌體，采用溶菌酶法以及硫酸銨鹽析法制備粗酶液。
1.4酶對溫度的耐受性
以TE pH8.0為緩沖液，不同溫度下保存20 min，測定酶活力[1]。
1.5酶對pH的耐受性
pH2.0采用Na2HP04檸檬酸緩沖液； pH4.0、pH5.0采用NaAc-HAc緩沖液；pH7.0采用磷酸鹽緩沖液；pH8.0、pH9.0采用Tris-HCl緩沖液；pH11?0、pH13.0采用甘氨酸-NaOH緩沖液；在25 ℃下保存30 min，測定酶活力。
1.6酶的最適反應(yīng)溫度
以TE pH8.0為緩沖液，分別在不同溫度下測定酶活力。
1.7酶的最適反應(yīng)pH
pH2.0采用Na2HP04-檸檬酸緩沖液； pH4.0、pH5.0采用NaAc-HAc緩沖液；pH7.0采用磷酸鹽緩沖液；pH8.0、pH9.0采用Tris-HCl緩沖液；pH11?0、pH13.0采用甘氨酸-NaOH緩沖液，采用酶活測試方法檢測酶活力。
1.8金屬離子對酶活力的影響
在反應(yīng)體系中分別加入各種金屬離子，終濃度均為5 mmol/L，采用酶活測試方法檢測酶活力。
2結(jié)果
在一般情況下，適合的金屬離子及適合的濃度會對酶的催化活性產(chǎn)生促進(jìn)作用，但如果反應(yīng)體系中金屬離子濃度過高，反而會對酶蛋白產(chǎn)生毒害作用。為此，可選擇對γ-GTP影響較大的鎂離子研究濃度與酶活力的關(guān)系。
Mg2+濃度對酶活力的影響比較顯著。在低于3.0 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，酶活力隨著Mg2+濃度的增加而增高，當(dāng)濃度達(dá)到3.0 mmol/L時酶活力最高，此后，酶活力隨著Mg2+濃度上升而緩慢下降。由此可見，在圖5所涉及的金屬離子（除亞錫離子外）雖然在5 mmol/L的濃度下對酶活力均有促進(jìn)作用，但在不同濃度下有些金屬離子也會對酶起到抑制作用。
在反應(yīng)體系中加入5 mmol/L的各種金屬離子除亞錫離子外均會對酶的活力有促進(jìn)作用。但在金屬離子中，一價金屬離子鉀離子和鈉離子以及三價金屬離子鐵離子和鋁離子的加入對酶的促進(jìn)作用明顯低于二價金屬離子錳離子、鈣離子和鎂離子。另外，添加重金屬離子亞錫離子由于會引起蛋白質(zhì)的變性，致使酶活力消失；有的金屬離子如錳離子、鎂離子等可較大程度的提高酶活力，這可能是由于這些金屬離子會對γ-GTP的活性中心產(chǎn)生影響的緣故。
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