關(guān)于微生物生長的幾種檢測方法
一、生長量測定法
1.1體積測量法：又稱測菌絲濃度法。
通過測定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養(yǎng)液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設(shè)定一定的離心時間（如5分鐘）和轉(zhuǎn)速（如5000rpm），離心后，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個重要監(jiān)測指標(biāo)。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設(shè)定一致的處理條件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養(yǎng)物，結(jié)果會有一定偏差。
1.2稱干重法：
可用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定一定的離心時間和轉(zhuǎn)速，進(jìn)行離心，并用清水離心洗滌1-5次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用紅外線烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾后用少量水洗滌，在40℃下進(jìn)行真空干燥。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時，常采用這種方法，如活性干酵母（activitydryyeast,ADY）,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。
1.3比濁法：
微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長作定時跟蹤時，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長監(jiān)測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600nm處用比色管定時測定發(fā)酵液的吸光光度值OD600，以此監(jiān)控E.Coli的生長及誘導(dǎo)時間。
1.4菌絲長度測量法：
對于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基上測定一定時間內(nèi)菌絲生長的長度，或是利用一只一端開口并帶有刻度的細(xì)玻璃管，到入合適的培養(yǎng)基，臥放，在開口的一端接種微生物，一段時間后記錄其菌絲生長長度，借此衡量絲狀微生物的生長
二、微生物計數(shù)法
2.1血球計數(shù)板法:
血球計數(shù)板是一種有特別結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平臺，兩嵴的表比兩平臺的表面高0.1mm，每個平臺上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央0.1mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統(tǒng)計一定大格內(nèi)微生物的數(shù)量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數(shù)。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。
2.2染色計數(shù)法：
為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計數(shù)，而直接用血球計數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計數(shù)法。借助不同的染料對菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧梢愿奖愕脑陲@微鏡下進(jìn)行活菌計數(shù)。如酵母活細(xì)胞計數(shù)可用美藍(lán)染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為無色，而死細(xì)胞為藍(lán)色。
2.3比例計數(shù)法：
將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細(xì)胞）濃度的液體與一待測細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。這種計數(shù)方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn)。
2.4液體稀釋法：
對未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計數(shù)，從最適宜的三個連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查最大或然數(shù)表MPN（mostprobablynumber）得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。
2.5平板菌落計數(shù)法：
這是一種最常用的活菌計數(shù)法。將待測菌液進(jìn)行梯度稀釋，取一定
體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合，或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上。保溫培養(yǎng)后，用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù)。一般以直徑9cm的平板上出現(xiàn)50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。
2.6試劑紙法：
在平板計數(shù)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計數(shù)用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)一定密度的玫瑰色微小菌落與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數(shù)快捷準(zhǔn)確，相比而言避免了平板計數(shù)法的人為操作誤差。
2.7膜過濾法：
用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會發(fā)橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光。
2.8生理指標(biāo)法：
微生物的生長伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量，含糖量，產(chǎn)氣量等，與生長量相平行的生理指標(biāo)很多，它們可作為生長測定的相對值。
2.9測定含氮量：
大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2后即可測出N2的量。
2.10測定含碳量：
將少量（干重0.2-2.0mg）生物材料混入1毫升水或無機(jī)緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.11還原糖測定法：
還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生(轉(zhuǎn)載于:mHg）的條件下才能生長，他們有完整的呼吸鏈，以分子氧為最終氫受體，具有超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶。
兼性厭氧菌:它是以在有氧條件下的生長為主也可兼在厭氧條件下生長的'微生物，有時也稱“兼性好氧菌”。
微好氧菌:只能在嬌滴滴額氧分壓（1.33~3.Pa，正常大氣中的氧分壓為0.2bar）下才能正常生長的微生物。
耐氧菌:耐氧性厭氧菌的簡稱，是一類可在分子氧存在下進(jìn)行發(fā)酵性厭氧生活的厭氧菌。
厭氧菌:有一般厭氧菌與嚴(yán)格厭氧菌（專性厭氧菌）之分。
超氧陰離子自由基:活性氧的形式之一，因有奇數(shù)電子，故帶負(fù)電荷；它既有分子性質(zhì)，又有離子性質(zhì)；其性質(zhì)極不穩(wěn)定，化學(xué)反應(yīng)力極強(qiáng)，在細(xì)胞內(nèi)可破壞各種重要生物大分子和膜結(jié)構(gòu)，還可形成其他活性氧化物，故對生物體極其有害。
超氧化物歧化酶(SOD):保護(hù)好氧菌免受超氧化物陰離子自由基的毒害的酶。按SOD分子中所含金屬輔基的不同分三類：1、含Cu、Zn的SOD，存在于幾乎所有真核生物的細(xì)胞質(zhì)中；2、含F(xiàn)e的SOD，主要存在原核生物中；3、含Mn的SOD，主要存在于真核生物的線粒體中。SOD除可清除超氧陰離子自由基外，還發(fā)現(xiàn)在防治人體衰老、治療自身免疫性疾病、抗癌、防白內(nèi)障、治療放射病和肺氣腫以及解除苯中毒等方面有一系列療效。
PRAS培養(yǎng)基:用嚴(yán)格厭氧方法配置、分裝、滅菌后的厭氧菌培養(yǎng)基，稱為預(yù)還原無氧滅菌培養(yǎng)基，即PRAS培養(yǎng)基。
厭氧罐:培養(yǎng)厭氧菌的裝置。
亨蓋特滾管技術(shù):一種集制備高純氮、以氮驅(qū)氧和全過程實現(xiàn)無氧操作、無氧培養(yǎng)、無氧檢測于一體，用于研究嚴(yán)格厭氧菌的技術(shù)和裝置。
厭氧手套箱:一種用于無氧操作和培養(yǎng)嚴(yán)格厭氧菌的箱形密閉裝置。
搖瓶培養(yǎng):一般將三角瓶內(nèi)培養(yǎng)液的瓶口用8層紗布包扎，以利通氣和防止雜菌污染，同時減少瓶內(nèi)裝液量，把它放在往復(fù)式或旋轉(zhuǎn)式搖床上作有節(jié)奏的震蕩，以達(dá)到提高溶氧量的目的。
曲:是一類用麩皮、米糠等疏松的固體營養(yǎng)料接種、培養(yǎng)微生物而制成的含氧活菌產(chǎn)品。
曲法培養(yǎng):將麩皮、碎麥或豆餅等固態(tài)基質(zhì)經(jīng)蒸煮和自然接種后，薄薄地鋪在培養(yǎng)容器表面，使微生物即可獲得充足的氧氣，又有利于散發(fā)熱量，對真菌來說，還有利于產(chǎn)生大量孢子。
通風(fēng)曲:一種機(jī)械化程度和生產(chǎn)效率都較高的現(xiàn)代大規(guī)模制曲技術(shù)，在我國醬油釀造業(yè)中廣泛應(yīng)用。
污染:有害微生物通過氣流、水流、接觸和人工接種等方式，傳播到合適的基質(zhì)或生物對象上而造成種種危害。
巴氏消毒法:有發(fā)過微生物學(xué)家巴斯德用于果酒消毒，故名。這是一種專用于牛奶、啤酒、果酒或醬油等不宜進(jìn)行高溫滅菌的也太風(fēng)味食品或調(diào)料的低溫消毒方法（一般在60-85度下處理30min至15s）。有兩種方法：1、低溫維持法；2、高溫瞬時法。
間歇滅菌法:適用于不耐熱的培養(yǎng)基滅菌。方法是：講帶滅菌的培養(yǎng)基放在80-100度下蒸煮15-60min，以殺滅其中所有的微生物營養(yǎng)體，然后放至室溫37度下保溫過
夜，誘使其中殘存的芽孢發(fā)芽，第二天再以同樣方法蒸煮和保溫過夜，如此重復(fù)3天即可在較低的滅菌溫度下同樣達(dá)到徹底滅菌的效果。
連續(xù)加壓蒸氣滅菌法:讓培養(yǎng)基在管道的流動過程中快速升溫、維持和冷卻，然后流進(jìn)發(fā)酵罐。
梅拉特反應(yīng):高溫滅菌時，培養(yǎng)基中得氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白質(zhì)）的游離氨基與羧基化合物（糖類）的羰基間發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基褐變同時，還降低了有關(guān)營養(yǎng)物成分，故應(yīng)設(shè)法避免。
石炭酸系數(shù):一定時期內(nèi)，被試藥劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度與達(dá)到同效果的石炭酸的最高稀釋度之比。
抗生素:一類有微生物或其他生物生命活動過程中合成的此生代謝產(chǎn)物或其人工衍生物，他們在很低濃度時就能一直或干擾他種生物的生命活力，因而可用作有兩的化學(xué)治療劑。
抗代謝藥物:一類在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與細(xì)胞內(nèi)必要代謝物的結(jié)構(gòu)相似，并可干擾正常代謝活動的化學(xué)物質(zhì)。3種作用：1、與正常代謝物一起共同競爭酶的活性中心，從而使微生物正常代謝所需要的重要物質(zhì)無法正常合成，例如磺胺類；2、“假冒”正常代謝物，使微生物合成出無法正常生理活動的假產(chǎn)物，如8-重氮鳥嘌呤取代鳥嘌呤而合成的核苷酸就會產(chǎn)生無正常功能的RNA；3、某些抗代謝藥物與某一生化合成途徑的終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，可通過反饋調(diào)節(jié)破壞正常代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，例如，6-巰基腺嘌呤可抑制腺嘌呤核苷酸的合成。
選擇毒力:大于病原菌具高度毒力而對其宿主基本無毒的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病源微生物的生長繁殖，借以達(dá)到治療該宿主傳染病的一種措施。
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