獸醫(yī)微生物的實習報告

一．實習目的

為了使學生能夠理論聯(lián)系實際，通過親自實地解剖感染小鼠，對小鼠的心、肝、脾進行麥康凱瓊脂平板劃線培養(yǎng)，以柯赫法則為這次實習的主線，達到鑒定出小鼠感染的菌種的目的，熟練運用微生物實驗課的所涉及的實驗操作和方法，提高實驗動手能力，分析實驗過程中可能出現(xiàn)的問題，并解決問題。特開設(shè)微生物教學實習，掌握基本技能，加深理論部分的理解，能夠獨立診斷出傳染病病菌，獲得嚴謹?shù)目茖W實驗素養(yǎng)。

二．實習材料

實驗動物：一只被感染小鼠，一只健康小鼠

實驗器械，主要包括：小鼠解剖工具手術(shù)剪、鑷子、蠟盤、釘子，接種棒、酒精燈、打火機、記號筆、手套、載玻片、槍頭、注射器、離心管。

實驗材料：麥康凱瓊脂平板、各種染色液（結(jié)晶紫溶液、碘溶液、酒精、沙黃水）、蒸餾水、培養(yǎng)基（普通肉湯培養(yǎng)基、蛋白胨培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基）、PBS重懸液、生化試驗材料（微量發(fā)酵管（葡、乳、枸、尿素、麥、甘醇、蔗、硫）、對二甲基氨基苯甲醛、乙醚、甲基紅、vp甲乙液）。

實驗主要儀器：離心機，分光光度器，溫箱，搖床，超凈工作臺

三．實習內(nèi)容

以柯赫法則為主線，通過對感染小鼠的剖解采樣、分離培養(yǎng)、鏡檢、擴增培養(yǎng)，然后把得到的純培養(yǎng)物對健康小鼠進行再次接種以獲得被感染小鼠，再次重復(fù)以上操作，把獲得的純培養(yǎng)物通過鏡檢觀察和做生化實驗來鑒定出感染小鼠的致病菌。

四．實習操作進程

第一天：實驗設(shè)計、討論癥狀、分離剖解

1 實驗設(shè)計：以小組為單位進行實驗設(shè)計，明確此次實驗主要法則是：柯赫法則。在老師的指導下確定此次實習的主要步驟，討論實驗中可能遇到的問題以及注意事項。

2 討論癥狀：比較觀察健康小鼠與病鼠，可見到病鼠一般呈萎靡狀，不活躍。每組領(lǐng)取一只感染小鼠觀察癥狀，體表基本正常。

3 分離剖解：先將麥康凱瓊脂平板分三區(qū)，依次寫上肝、脾、心。右手抓起小鼠尾巴，將小鼠搖暈，采用頸椎脫臼法將小鼠處死。將小鼠尸體仰臥固定于蠟盤上，充分露出胸腹部。先用小鼠腹部柔軟部用剪刀剪一小口，然后從該小口處往上、往下剪將皮毛剝離，剝離腹膜暴露出肝臟和脾，可觀察到有輕微的肝腫脹，顏色變淡。將肝和脾切開一小口，用接種環(huán)取樣，在麥康凱瓊脂平板的相應(yīng)區(qū)域進行劃線分離。再打開胸腔觀察，可見胸腔有出血現(xiàn)象和凝血塊，剪開心包膜，將心臟切一小口，用接種環(huán)取樣，在麥康凱瓊脂平板的相應(yīng)區(qū)域進行劃線分離。寫上班級組別，日期，置于溫箱中培養(yǎng)至第二天早上8點。

第二天：挑取單菌落，鏡檢，擴增培養(yǎng)，重懸，測OD配濃度，小鼠腹腔注射

1 挑取單菌落：觀察麥康凱瓊脂平板上菌落的形態(tài)為圓形，邊緣整齊，表面光滑，暗紅色，圓心處顏色較邊緣淺。挑去單個菌落，畫上記號準備做后續(xù)試驗。

2 鏡檢：選取所挑選菌落的一半進行抹片。取干凈玻片，滴半滴去離子水，用接種環(huán)挑取菌進行抹片、干燥固定、采用格蘭染色法染色：草酸銨結(jié)晶紫染色1-2’，水洗，革蘭氏碘液媒染1-2’，水洗，95%酒精脫色約30’’-1’，水洗，沙黃水溶液復(fù)染10 ’ ’-30 ’ ’，水洗。吸干，鏡檢。觀察到該菌被染成紅色，是格蘭陰性菌。

3 擴增培養(yǎng)：選取剩余的菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，置于溫箱培養(yǎng)9個小時至菌的生長對數(shù)期。 

4 重懸測OD值配濃度：下午5點左右，將培養(yǎng)的菌轉(zhuǎn)入無菌小管中離心，離心后可見菌沉于管底，在超凈工作臺內(nèi)操作，去上清液，用槍頭吸取PBS液至去了上清液的菌管中，反復(fù)吹打使其重懸，然后再次離心，去上清，重懸，通過分光光度計測得OD590的值，配成2*10^7CFU濃度的菌液。

5 小鼠腹腔注射：每組挑選一只健康小鼠，在頭部或尾部做上記號，用右手抓住鼠尾，將其搖暈，令其前爪抓住鐵絲蓋上，然后用左手的拇指和食指捏住小鼠頭頸部皮膚，并翻轉(zhuǎn)左后使其腹部朝上，將其尾巴夾在左手掌與小指之間，右手把持注射器吸取2mL菌液，在股后側(cè)面插入針頭，先刺入皮下，后進入腹腔，注射時阻力，皮膚也無泡隆起。注射完將小鼠放回鼠籠即可。

第三天：觀察小鼠發(fā)病情況

小組成員分時間段觀察小鼠感染情況，見小鼠瀕死的盡快解剖接種分離致病菌。若 一整天未見小鼠有異常情況的等第二天解剖

第四天：剖解劃線培養(yǎng)

雖然小鼠未見萎靡，由于預(yù)訂的感染時間差不多，可以進行解剖接種第一天的操作，

可見體表有淤血點，剖開的小鼠肝臟流出大量的血液。其余均同第一天的操作，將麥康凱瓊脂平板的上所接的菌置于溫箱中培養(yǎng)。

第五天：生化鑒定

觀察到平板上只有一個較小的暗紅色菌落，挑取該菌落進行擴增培養(yǎng)9小時至細菌生長的對數(shù)期。下午6點觀察，培養(yǎng)液依舊是澄清的，很可能沒有長菌。為做進一步的驗證，進行生化試驗。將該菌接入微量發(fā)酵管（）和蛋白胨以及葡萄糖蛋白胨中，培養(yǎng)至第二天看結(jié)果。

第六天：觀察結(jié)果，整理報告

生化試驗無任何反應(yīng)，說明接的菌為雜菌或污物，整理實驗報告并分析失敗原因。

六．實驗結(jié)果與分析

此次試驗失敗

給小鼠攻毒，未能分離出致病菌，因此也無法鑒定出小鼠被感染的病原菌為何種腸桿菌科

試驗失敗原因可能有：

1、接種棒火焰消毒后，等待冷卻的時間過短，接種棒接種菌時將菌燙死

2、由于小鼠的免疫力強，使得感染小鼠的病原菌被免疫掉了，因此未接種到治病菌

3.給小鼠注射的量或濃度還不夠未能達到使小鼠感染的目的

4、在第一次從小鼠體內(nèi)分離出來的菌可能不是致病菌，或者麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)出來的 菌落不止一種，而我們挑選到的某一菌落恰好不是致病菌。

5、在進行腹腔注射時，可能沒有注射到腹腔，而只注射到皮下，或者其它部位。

6、采樣時可能由于接種環(huán)未完全伸入到心、肝、脾的組織中，或者伸到的組織里 恰好沒有致病菌

7、可能由于小鼠感染的時間過短，還未達到菌生長曲線的高峰期

七．思考與總結(jié)

1 此次試驗失敗的原因有很多在我看來最有可能的原因有以下幾點：

（1） 小鼠免疫:由于這些小鼠是實驗室的小鼠，長期被用來做各種致病菌的實驗，使得它們獲得一定的免疫，所以雖然注射了足夠使小鼠感染發(fā)病的劑量，但也被小鼠免疫掉了，而無法從小鼠體內(nèi)獲得病料。

（2） 病料不夠：從學姐那了解到，她們做攻毒實驗的動物，都是將整個組織塊磨碎以后，再接到培養(yǎng)基上，而我們做實驗是只是用接種棒挑取一點，接種棒上粘到的病料比較少或根本沒有，因此培養(yǎng)不出菌。

（3） 挑取的單菌落未必是致病菌：由于平板上長出可能不止一種菌，因此挑到的單菌落，未必是致病菌。

2為什么擴增出來的菌不直接注射小鼠，而要經(jīng)過離心？

因為菌可能會產(chǎn)生毒素，若直接注射可能就無法判斷使小鼠發(fā)病的到底是毒素作用，還是因為病菌在小鼠體內(nèi)繁殖感染而造成的。

3 腸桿菌科有哪些，特征有哪些？

學生自我鑒定：

2011年5月16號到21號期間進行了維持一周的微生物實習，在微生物實習期間，我能夠做到主動和小組成員交流、合作、解決問題，認真完成實驗操作，學會靈活運用自己的專業(yè)知識解決問題。

通過這段時期的實習，我們對無菌操作有了進一步的理解，掌握了儀器操作的基本技能，鞏固了理論部分的知識，也了解到公共衛(wèi)生意識的重要性。

實習不過短短的五天，在這短暫的五天內(nèi)，，我們有過發(fā)現(xiàn)時的喜悅，有過解剖小鼠時的緊張，有過培養(yǎng)不出菌時的困惑，但最終我們收獲了知識，也收獲了友誼，在合作中共同進步，在困難中共同進退，一切的困難便能迎刃而解。

這次微生物實習為我們專業(yè)的繼續(xù)拓展提供了寶貴的經(jīng)驗，為動物醫(yī)學本科專業(yè)的我們學習后續(xù)課程奠定扎實的基矗

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