- 相關(guān)推薦
影響免疫檢測(cè)的因素有哪些
影響免疫檢測(cè)的因素有很多，包括緩沖液、封閉、抗體、清洗、檢測(cè)底物等等。下面是yjbys小編為大家?guī)?lái)的影響免疫檢測(cè)的因素的知識(shí)，歡迎閱讀。
緩沖液
最常用的兩種緩沖液是磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris緩沖液(TBS)。調(diào)整配方中緩沖液組分的各種改良配方已見(jiàn)諸期刊。緩沖液的關(guān)鍵要求是它應(yīng)有助于保持抗體的生物活性。因此，離子強(qiáng)度和pH值應(yīng)相當(dāng)接近生理狀態(tài)。PBS的配方(磷酸鹽總濃度10mM)適用于廣泛的抗體和檢測(cè)底物。
在孵育過(guò)程中，裝有膜的容器應(yīng)輕輕搖動(dòng)。緩沖液的量應(yīng)足夠，完全覆蓋膜，使其在緩沖液中自由漂浮。如果不止一張印跡放在容器中，緩沖液容量不足會(huì)導(dǎo)致印跡膜粘在一起。這將影響孵育溶液的充分接觸，導(dǎo)致各種假象，如背景高、信號(hào)弱和靈敏度不均勻等。
封閉
要獲得有意義的結(jié)果，必須保證抗體只與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合，而不與膜結(jié)合。利用惰性蛋白、非離子去污劑，或無(wú)蛋白的封閉劑來(lái)封閉膜上未被占據(jù)的位點(diǎn)，可減少抗體的非特異結(jié)合(NSB)。
封閉劑與膜的親和力應(yīng)高于抗體。它應(yīng)填滿膜上未被占據(jù)的位點(diǎn)，但不會(huì)替換膜上的目標(biāo)蛋白。最常用的封閉劑是牛血清白蛋白(BSA，0.2-5.0%)、脫脂牛奶、酪蛋白、明膠、吐溫20去污劑的稀釋液(0.05-0.1%)以及Bløk®試劑。封閉劑通常溶解在PBS或TBS中。
與封閉相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)包括：選擇不適當(dāng)?shù)姆忾]劑或過(guò)量封閉會(huì)替換或掩蓋目標(biāo)蛋白質(zhì)。因此，封閉劑的正確選擇對(duì)成功的免疫檢測(cè)很關(guān)鍵。例如，奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白標(biāo)記的抗體，因?yàn)榕Ｄ讨泻刑堑鞍缀蜕锼亍Ｔ谟昧姿峄禺愋钥贵w對(duì)磷酸化蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)，如果采用粗蛋白制劑作為封閉劑，由于這些制劑中可能含有磷酸酶，而印跡上的磷酸化蛋白會(huì)被這些酶去磷酸化，就有可能會(huì)影響分析結(jié)果。研究表明，在封閉液中添加磷酸酶抑制劑可增強(qiáng)磷酸化特異性抗體的信號(hào)。此外，適用于一種抗原-抗體組合的封閉劑可能不適用于其他組合。
封閉液被點(diǎn)樣在空白的PVDF膜上，而膜已在甲醇中浸潤(rùn)，并在TBS中平衡。隨后在印跡上添加檢測(cè)試劑，孵育5分鐘，并曝光在X射線膠片上。暗斑的出現(xiàn)則表明封閉劑與檢測(cè)試劑不兼容。如果在標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡操作中用Immobilon®-P轉(zhuǎn)印膜來(lái)替代Immobilon®-PSQ轉(zhuǎn)印膜，那么封閉液可能不足以飽和膜表面�？赡苄枰嗟那逑床襟E來(lái)降低背景。
抗體
在封閉之后，印跡與一個(gè)或多個(gè)抗體孵育。第一個(gè)抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，而第二個(gè)抗體與第一個(gè)結(jié)合。第二個(gè)抗體結(jié)合有酶或染料，可用來(lái)指示蛋白的位置。
盡管一抗能直接標(biāo)記，但使用二抗有明顯的優(yōu)勢(shì)。首先，不止一個(gè)二抗分子能夠與單個(gè)一抗分子結(jié)合，形成信號(hào)擴(kuò)增。其次，標(biāo)記的二抗(酶-抗體結(jié)合物)可用于大量不同特異性的一抗，從而不再需要標(biāo)記多個(gè)一抗。
多克隆或單克隆的一抗都可使用。多克隆抗體通常是以抗血清或親和純化的抗體形式提供的。單克隆抗體是在腹水或組織培養(yǎng)液中表達(dá)的，可直接使用或進(jìn)行親和純化。一定要記住，變性蛋白可能無(wú)法被天然抗原培育出的抗體所識(shí)別。在某些情況下，可能需要非變性凝膠來(lái)進(jìn)行印跡�？贵w以緩沖液和封閉液稀釋，以避免與膜的非特異結(jié)合�？贵w稀釋液通常也包含痕量的吐溫20或另一種去污劑，以防止抗體的非特異聚集。許多發(fā)表的化學(xué)發(fā)光操作需要在封閉液和抗體稀釋液中添加0.1%(v/v)吐溫20。我們必須認(rèn)識(shí)到，高于0.05%(v/v)的濃度有可能從膜上洗掉一些印跡的蛋白質(zhì)。
提高吐溫20去污劑的濃度通常會(huì)降低背景。一種更簡(jiǎn)單且更經(jīng)濟(jì)的策略是降低抗體的濃度，特別是二抗(詳見(jiàn)圖1)�？贵w必須特異針對(duì)目的蛋白，不能與封閉液中的組分交叉反應(yīng)，且應(yīng)該是相對(duì)純凈的。其他蛋白質(zhì)或聚集物形式的雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合和背景增高。
免疫檢測(cè)是一種極其靈敏的方法。為了實(shí)現(xiàn)高的信噪比和最高的靈敏度，一抗和二抗的濃度應(yīng)針對(duì)每種情況來(lái)優(yōu)化。一般來(lái)說(shuō)，高倍稀釋一抗或降低凝膠上的蛋白上樣量可減少非特異信號(hào)。高倍稀釋酶標(biāo)記的二抗可最大限度降低整體的高背景。
一抗和二抗的最佳濃度也取決于檢測(cè)試劑的靈敏度。高靈敏度的試劑(檢測(cè)到飛克級(jí))與低靈敏度的試劑(檢測(cè)到皮克級(jí))相比，抗體用量可減少20倍。抗體濃度的優(yōu)化取決于檢測(cè)底物的例子如圖13所示。在使用最靈敏的檢測(cè)試劑時(shí)，過(guò)量的抗體導(dǎo)致高的非特異性和整體背景增高(左上)。在這種情況下，將一抗稀釋度從1:1,000提高到1:10,000，改善了信噪比。在使用沒(méi)那么靈敏的檢測(cè)試劑(中間和最下面一行)時(shí)，抗體需要更為濃縮，以產(chǎn)生相同的信號(hào)。
清洗
清洗印跡，從膜上去除未結(jié)合的抗體，它們可能導(dǎo)致高背景和檢測(cè)不佳。通常使用吐溫20的PBS或TBS稀釋液(0.05% v/v)，特別是當(dāng)抗體制劑是粗制的，或高濃度使用時(shí)。如前所述，濃縮的去污劑溶液可能導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)從膜上洗脫。對(duì)于高度純化的抗體，往往只使用緩沖液進(jìn)行清洗。
所需的清洗次數(shù)最好根據(jù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。清洗太少會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的背景，而清洗過(guò)度有可能洗脫抗體并降低信號(hào)。建議至少清洗三次，每次5分鐘。
在TBS清洗液中添加最多0.5M NaCl和0.2% SDS，并將清洗時(shí)間延長(zhǎng)至2小時(shí)，可降低頑固的背景。
【影響免疫檢測(cè)的因素有哪些】相關(guān)文章：
日本留學(xué)的重要影響因素有哪些07-26
日本留學(xué)選校影響因素有哪些09-30
腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的影響因素有哪些11-07
影響環(huán)境藝術(shù)設(shè)計(jì)的因素有哪些07-26
影響新加坡留學(xué)生就業(yè)的因素有哪些10-09
影響航母艦載機(jī)安全因素有哪些10-03