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酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)方法原理
免疫酶技術(shù)是指在一定的生物反應(yīng)器內(nèi),利用酶的催化作用,進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化的技術(shù).其應(yīng)用范圍已遍及工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化學(xué)分析、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)和生命科學(xué)理論研究等各個(gè)方面。下面是小編給大家酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)方法原理，希望能幫到大家!
酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)
(1)酶和酶作用的底物：
�、倮备^(guò)氧化酶(HRP)：是一種糖蛋白，含糖量約18%;分子量為44kD;是一種復(fù)合酶，由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素)結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無(wú)色糖蛋白，在275nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰;輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰。在反應(yīng)中H2O2是受氫體底物，DH2無(wú)色的供氫體底物，在HRP的催化下脫氫而顯色，此即HRP作為示蹤物的原理。
�、趬A性磷酸酶(AP)：是從牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。從大腸桿菌提取的最適pH為8.0;用小牛腸粘膜提取的AP最適pH為9.6。
③其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。
(2)酶標(biāo)記的抗體或抗原：
稱為結(jié)合物。制備方法通常有戊二醛交聯(lián)法(包括有一步法和二步法)和過(guò)碘酸鹽氧化法。標(biāo)記抗體的最佳用量：通常采用棋盤滴定法進(jìn)行滴定。
(3)固相載體：
主要試劑：固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物。可作固相載體物質(zhì)最常用的是聚苯乙烯。與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。聚苯乙烯作為ELISA固相載體，載體還包括微孔濾膜和含鐵磁性微粒。聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可切割，價(jià)廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時(shí)也略高。
(4)免疫吸附劑：
固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過(guò)程稱為包被。如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過(guò)程稱為封閉。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時(shí)間而不失去其免疫活性。
酶免疫技術(shù)的方法
ACA(抗心磷脂抗體)主要通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞合成PGI2，干擾血栓調(diào)節(jié)素、纖溶酶原激活劑和蛋白質(zhì)C系統(tǒng)的活性，抑制抗凝血酶III的活化等而致凝血前高凝狀態(tài)，與復(fù)發(fā)性動(dòng)靜脈血栓形成、反復(fù)自然流產(chǎn)及血小板減少癥關(guān)系密切。
其主要程序?yàn)橛眉冃牧字臒o(wú)水乙醇溶液包被聚苯乙烯板，封閉后分別于標(biāo)本孔和對(duì)照孔中加入一定稀釋度的被檢血清及陽(yáng)性與陰性對(duì)照血清，之后加入酶標(biāo)二抗和酶底物，終止反應(yīng)后肉眼觀察結(jié)果或測(cè)吸光度(A)值。
具體步驟如下：
預(yù)步驟：先用一定濃度的心磷脂溶液包被聚苯乙烯板的小孔，4℃冰箱過(guò)夜，次日取出甩盡液體備用。
(1) 用微量移液器分別加待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各100μl于1、2、3孔中，370C水浴箱溫育30min。
(2) 用PBS液洗板3次，每次3min，甩干。
(3) 每孔加入酶結(jié)合物2滴，370C水浴箱溫育30min。
(4) 用PBS液洗板3次，每次3min，甩干
(5) 每孔分別加入顯色A液、B液各1滴，混勻。370C水浴箱溫育5-10min。
(6) 取出肉眼觀察結(jié)果。如待檢血清溶液與陽(yáng)性對(duì)照一致均為藍(lán)色，表明待檢血清為ACA+血清。
酶免疫技術(shù)的技術(shù)原理
免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合的一種方法。它以酶作為標(biāo)記物，與抗體或抗原聯(lián)結(jié)，與相應(yīng)的抗原或抗體作用后，通過(guò)底物的顏色反應(yīng)作抗原抗體的定性和定量，亦可用于組織中抗原或抗體的定位研究，即酶免疫組織化學(xué)技術(shù)。
目前應(yīng)用最多的免疫酶技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，它是使抗原或抗體吸附于固相載體，使隨后進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)均在載體表面進(jìn)行，從而簡(jiǎn)化了分離步驟，提高了靈敏度，即可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體。實(shí)驗(yàn)方法包括間接法、夾心法及競(jìng)爭(zhēng)法。
為了檢測(cè)抗原可用夾心法。將特異性抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯制成的小管、小盤或小孔)上，然后加被測(cè)溶液，倘樣品中有相應(yīng)抗原，則與抗體在載體表面形成復(fù)合物。洗滌后加入酶標(biāo)記的特異性抗體，后者通過(guò)抗原也結(jié)合到載體的表面。洗去過(guò)剩的標(biāo)記抗體，加入酶的底物，在一定時(shí)間內(nèi)經(jīng)酶催化產(chǎn)生的有色產(chǎn)物的量與溶液中抗原含量成正比，可用肉眼觀察或分光光度計(jì)測(cè)定。
為了檢測(cè)抗體可用間接法。使抗原吸附于載體上，然后加入被測(cè)血清，如有抗體，則與抗原在載體上形成復(fù)合物。洗滌后加酶標(biāo)記的抗球蛋白(抗抗體)與之反應(yīng)。洗滌后加底物顯色，有色產(chǎn)物的量與抗體的量成正比。
常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)，相應(yīng)的底物分別是鄰苯二胺(OPD)和對(duì)硝基苯磷酸鹽，前者呈色反應(yīng)為棕黃色，后者為藍(lán)色�？捎媚繙y(cè)定性，也可用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度(OD)值以反映抗原含量。
酶免疫技術(shù)基本原理及種類
一、基本原理
酶聯(lián)免疫技術(shù)和其他免疫技術(shù)一樣,都是以抗體和抗原的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的,其差別在于酶免疫方法以酶或者輔酶標(biāo)記抗原或者抗體,用酶促反應(yīng)的放大作用來(lái)顯示初級(jí)免疫學(xué)反應(yīng),使檢測(cè)水平接近放射免疫測(cè)定法。酶免疫測(cè)定法可分為非均相免疫測(cè)定法和均相免疫測(cè)定法,非均相法又有固相法和液相法之分。實(shí)踐中,常用的是非均相酶固相免疫測(cè)定法即 ELISA 法,該法將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面,將抗原或抗體相關(guān)物質(zhì)與酶交聯(lián)成酶結(jié)合物,一方面保持了與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合的免疫特性,另一方面還具有酶活性。當(dāng)酶結(jié)合物同相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后,則形成酶標(biāo)抗原-抗體復(fù)合物,復(fù)合物上的酶遇到相應(yīng)底物時(shí),可以催化產(chǎn)物水解、氧化或還原,從而產(chǎn)生有色物質(zhì)。根據(jù)有色物質(zhì)的有無(wú)及其濃度,即可間接推斷被檢樣品中有無(wú)相應(yīng)抗原或抗體存在、數(shù)量多少,從而達(dá)到定性和定量測(cè)定的目的。ELISA 測(cè)定原理見圖1-1。
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圖1-1 ELISA 測(cè)定原理示意圖
二、ELISA 的種類
在實(shí)際應(yīng)用中 ELISA 技術(shù)主要有直接法、間接法、雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲包被法、ABS-ELISA 法、PCR-ELISA 法、A 蛋白酶聯(lián)法、斑點(diǎn)免疫吸附法和組織印跡法等幾種類型,下面主要介紹幾種常用的方法,分別是直接法、間接法、雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲包被法。
1、直接法測(cè)抗原
(1)將受檢抗原吸附于固相載體表面,洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
(2)加入酶標(biāo)記的抗體,形成酶-抗體-抗原復(fù)合物,洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
(3)加底物顯色,固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色,測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。
試驗(yàn)中的一抗都得用酶標(biāo)記,但不是每種抗體都適合作標(biāo)記,費(fèi)用相對(duì)提高。
2、間接法測(cè)抗體
(1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
(2)加受檢抗體。標(biāo)本中的抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗體-抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
(3)加酶標(biāo)二抗。固相免疫復(fù)合物上的受檢抗體與酶標(biāo)二抗結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)二抗。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量相關(guān)。
(4)加底物顯色,固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色,測(cè)知標(biāo)本中抗體的量。
間接法的優(yōu)勢(shì)為:二抗可以加強(qiáng)信號(hào),而且有多種選擇能做不同的測(cè)定分析。不加酶標(biāo)記的一級(jí)抗體則能保留它最多的免疫反應(yīng)性;缺點(diǎn)為交互反應(yīng)發(fā)生的概率很高。
3.雙抗體夾心法檢測(cè)抗原
(1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
(2)加受檢抗原。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原-抗體復(fù)合物,洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
(3)加酶標(biāo)抗體。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合,徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體,此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。
(4)加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色,測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。
這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性,常用于檢測(cè)抗原。
4、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原
(1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體,洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
(2)向待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量的酶標(biāo)抗原的混合溶液,使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原,則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原,則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì),使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原,酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)最充分的量,洗滌。
(3)加底物顯色。參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多,故顏色最深。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差,代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測(cè)管顏色越淡,表示標(biāo)本中抗原含量越多。
競(jìng)爭(zhēng)法一般用于抗原中的雜質(zhì)不容易去除,或者抗原的特異性差的情況下。
5、捕獲包被法測(cè)定抗體
血清中針對(duì)某些抗原的特異性 IgM 常和特異性 IgG 同時(shí)存在,后者會(huì)干擾 IgM 抗體的測(cè)定。因此,測(cè)定 IgM抗體多用捕獲法,先將所有血清 IgM(包括特異性 IgM 和非特異性 IgM)固定在固相上,在去除 IgG 后再測(cè)定特異性 IgM。
(1)將抗人 IgM 抗體連接在固相載體上,形成固相抗人 IgM,洗滌除去雜質(zhì)。
(2)加入稀釋的血清標(biāo)本。血清中的 IgM 抗體被固相抗體捕獲,洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
(3)加入特異性抗原試劑。它只與固相上的特異性 IgM 結(jié)合,洗滌。
(4)加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體,使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合,洗滌。
(5)加底物顯色,如有顏色顯示,則表示血清標(biāo)本中的特異性 IgM 抗體存在,是為陽(yáng)性反應(yīng)。
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