細胞培養(yǎng)注意事項
細胞培養(yǎng)是指在體外模擬體內環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。下面是小編整理的細胞培養(yǎng)注意事項，僅供參考，大家一起來看看吧。
無菌操作基本技術
1.實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。
2.無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
3.小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4.工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少ClassII)。操作過程中，應避免引起aerosol之產生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。
5.定期檢測下列項目：
5.1.CO2鋼瓶之CO2壓力
5.2.CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。
5.3.無菌操作臺內之airflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預濾網(300小時/預濾網，3000小時/HEPA)。
6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750)，定期更換水槽的水
請問工作濃度的胰酶是不是應保存在－20度？如果放在4度冰箱可以保存多久呢？是不是幾個小時就會失去活性？
平時放在-20度，分裝在50毫升螺口管，用時拿一管放4度用。
1.認真按照操作規(guī)程進行實驗，一般不大會導致污染，很多情況下是由于所用的試劑或培養(yǎng)基有污染而使實驗失敗
2.粉末培養(yǎng)基配制好后(加了血清)，一般在4度盡量不要超過1個月，如在-20度存放時間可長一些，但最好也不要超過3-4個月，可能對于永生化細胞株來說要求不是太高，但我在過去的4年里一直是作原代細胞培養(yǎng)的，細胞嬌弱，經驗表明放置時間不宜過長。
3.關于實驗用品的清洗與消毒，我的經驗是：用過的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上，然后加少許清洗劑，以超聲波洗滌30min左右，(如無超聲波洗滌器可用軟毛刷輕輕刷洗干凈)，撈出晾干，再在鉻酸洗液中浸泡6-18h(或過夜)后，自來水清洗10-15遍，雙蒸水清洗3-4遍，晾干，高壓消毒后即可使用。
許多塑料制品也可以高壓消毒，例如培養(yǎng)瓶蓋，膠塞，吸頭等。不能用于高壓的一般均已制成一次性作用的商品了，當然如果money有限，如進口的培養(yǎng)板、皿等，也可以重復使用1-2次，我當時使用方法是將其完全清潔后，使用前在紫外燈下敞開照射1-1.5h即可，我做過多次，沒有出現(xiàn)問題。塑料培養(yǎng)瓶由于清洗消毒不便，最好不要重復使用，如一定要重復用，可用環(huán)氧乙烷等消毒，(消毒后一定要放置半年以上方可使用)
在光鏡下，上皮細胞通常呈“鋪路石”樣排布，細胞之間有拉絲現(xiàn)象（即距離較遠的細胞可以通過細長的觸手相連），細胞有成片生長的特性。而間質細胞通常呈梭形，沒有有成片生長的特性，細胞之間的聯(lián)系不緊密。但是細胞的形態(tài)特征會因為生長條件的改變而改變，如HeLa細胞是上皮細胞，但是在酸性培養(yǎng)條件下會變?yōu)樗笮巍?/p>
上皮細胞之間都有特征性的緊密連接（橋粒）結構，因此可以通過觀察培養(yǎng)細胞的超微結構來判斷細胞的類型，如果有緊密連接，就必然是上皮細胞。這是一錘定音的證據(jù)。注意不要把細胞消化下來做電鏡，要用細胞刮刮下來后做電鏡。
此外每一種上皮細胞都有其特征的細胞角蛋白的表達,可以查一下子宮內膜腺上皮細胞表達的CK分子，然后進行免疫細胞化學的鑒定，細胞在偏堿的情況下培養(yǎng)，耐受能力會逐漸下降，可能是產生脫壁現(xiàn)象的原因，后來我重新測了一下培養(yǎng)基，為7.5左右，我用滅菌的HCL調了一下，培養(yǎng)基顏色變成淡紅透亮，再次培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細胞貼壁比較好了，搏動效果也不錯，因此，我以后每次培養(yǎng)前都要重新調好PH值，我覺得很多因素是能影響PH值的血清質量不好，影響了細胞生長。所以，我認為以后養(yǎng)細胞，用的血清濃度最好是每批次血清都摸一下，不一定要以參考文獻為準，畢竟國產的血清質量差異比較大啊。
細胞無菌操作是關鍵，對于配制培養(yǎng)液時，有些人為了讓培養(yǎng)粉充分溶解，攪拌4小時或更長時間。其實這完全沒有必要，一般培養(yǎng)基的固體組分還是易溶于水的，攪拌的時間長了會增加污染機會，雖然后來濾過除菌了，但細菌的代謝產物比如脂多糖誰能夠把它濾掉？細菌的代謝是很快的，甚至在常溫下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的經驗就是攪拌30min-60min就把它過濾。
另外關于培養(yǎng)基的pH問題，一般按照說明書操作，加入所說的NaHCO3量，與預計的pH不會有什么距離，也就是說基本上不用調pH，如果相差大，要考慮三蒸水的質量是否有所下降，當然這時調pH也是不得已而為之。我配培養(yǎng)基時基本上不調pH，只是用試紙檢測一下pH，觀察一下培養(yǎng)基的顏色。
�。�1）東西一定要用自己的。既不要借別人的，也不要借給別人。可能大家覺得比較自私。實際上還是很有好處的。并不是每個人的操作都規(guī)范，因此相互之間串著用，很容易造成交叉污染。
（2）我習慣口對口倒液體，在倒前倒后都要在酒精燈上過一下。自己認為比起用吸管吸更能很好的防止污染。步驟越簡單，越能防止污染。而且還能節(jié)省很多吸管。
�。�3）一次將所有的所需要試劑、工具放入工作臺。不要做到半路，又出工作間拿東西，這樣增加了污染的機會。
�。�4）整個操作要快、動作要輕、而且不要干其他的事情。比如手機響了，最好不要接。我一般操作的時候將手機關了，手機聲音響起，好煩躁。
（5）我一般開紫外線照射臺的時候，就將培養(yǎng)基、酶、DHANKS液那到室外讓它自然升溫。這樣40分鐘后，溫度也升上來了。有很多人將他放到37度水浴鍋里加熱。一定要注意水浴鍋的衛(wèi)生，有的常年不清洗，里面很臟，容易在外面瓶身上吸附大量細菌。因此用它的也一定要勤換水。從水域鍋那出后，最好找個毛巾插干上面的水。
�。�6）操作前要洗手，用75%酒精搽手。用完操作臺，要打掃衛(wèi)生。
細胞要經常凍存，我一般只要細胞狀態(tài)好就將細胞凍存起來。細胞狀態(tài)差了，扔掉，重新復蘇。這是一個必須養(yǎng)成的習慣。畢竟很多情況下，細胞并不是因為污染了，才讓你感到頭痛。這樣你不會擔心沒有種子了。我一般是不加雙抗的，只要注意，不會污染。
過濾時不要用槍吹細胞!!如果用力吹,篩網就像刀片一樣,把你的細胞全部切碎!!
.刷玻璃器皿的過程：初洗、泡酸（一天）、自來水沖洗（10遍）、純化水沖洗（3遍）、注射用水沖洗（3遍）。感覺過于苛刻，自來水只沖洗3遍。被老師發(fā)現(xiàn)后，一陣痛批，才知道這是極其關鍵的一步，殘留的酸可能會抑制細胞生長，甚至導致細胞死亡，痛失辛苦得來的細胞，心血付之東流。無知不能無畏，一定不能大意。
做好準備工作。不要急于投身到細胞培養(yǎng)中去，要先設定計劃：步驟，工具，試劑。特別是將細胞用于大規(guī)模生產時，尤其如此。經過干熱滅菌的容器一般認為可以在一周內保持無菌狀態(tài)，如果準備多了，用不完的就得重新滅菌，耗費能源、占用滅菌空間，不值得；干熱滅菌需要一天的時間，當器皿準備不足時，只能干著急，錯過了最佳操作時間，也許得很久才能將細胞狀態(tài)再調整好。
對于驕氣的細胞，我一般都是第一天處理完后，加少量培基（夠蓋住瓶底部），第二天換液，以免死細胞和碎片對活的產生不良影響。
新配的培養(yǎng)基直接用很清亮，但是在－20度保存一段時間后再溶解就要出現(xiàn)很多雜質，用37度水孵育沒有效果，握在手里不停搖動非常有效。其實對于操作熟練的人來說，污染并不是我們想像那樣容易出現(xiàn)，園子里很多人都問否污問題，而培養(yǎng)基的PH值往往被忽略，而且大多數(shù)人都習慣于一次配制1升培養(yǎng)基，分裝成10X100ml，用1瓶，另外9瓶放在－20度保存，很容易出現(xiàn)結晶，鏡下看就是一些桿狀的物資，有時候晃動培養(yǎng)基，肉眼就可以看到很多沉淀，這就需要我們在用之前好好搖勻了。
操作中的安全：
a、我犯的一個巨經典的錯誤至今難忘，剛做時酒精擦手，擦鑷子，濕淋淋的就拿鑷子過火，結果火順著鑷子著到手上，雖然不怎么熱，可是我手上的汗毛啊，555，都被燒了。這個錯誤以后再也沒犯。
b、過完火的試管口一定不能摸，時刻記著只拿試管的下1/2。
c、給酒精燈加酒精永遠記住不要拿酒精燈口那個燈心管，否則終身難忘。
d、當酒精燈出現(xiàn)什么意外時一定要鎮(zhèn)靜，先讓他著一會可能沒事，不要慌亂中打壞別的東東。
e、離心機尤其高轉速時，配平當然要牢記，可是一定要檢查一下離心機里還有沒有其他東東（有一次我離東西，著急，放進去剛離一會我就覺得聲音不對，打開一看里面竟然有一根別人沒有拿出來的小管子）。還有一次配完平就打開離心機蓋準備離心，結果嚇個半死，原來別人正在離心，幸好管子沒飛出來
細胞凍存：當細胞狀態(tài)好，或者代數(shù)比較早，一定要大量凍存，不要吝惜暫時的大批使用血清，當細胞狀態(tài)不好，長不起來的時候，馬上取出來復蘇，省時省力，不要去嘗試努力恢復狀態(tài)不好的細胞，費時間也費血清，會令你痛苦不堪。另外凍存的細胞不要放到一個地方，－80度，液氮（甚至不同的液氮罐）都放一點，誰也不敢保證不出意外，冰箱也可能有化的時候（我們－20度冰箱就化過），都放在一塊容易全軍覆沒。
按照試劑的保存標準保存，象血清、胰酶等沒開封的-20℃，開封后-4℃保存一般不超過7天（用完它吧，不然浪費了）
5、一定要弄清楚每個組分的作用，特點，比如NaHCO3容易分解，因此培養(yǎng)基在過濾除菌時pH會上升，一般是0.1-0.3，所以在過濾之前，要把培養(yǎng)基的pH調低0.1-0.3。如果你不了解NaHCO3容易分解的特點，就不會做相應的處理，那么培養(yǎng)基不符和要求，細胞就長不好。
臺盼藍主要用來鑒定原代培養(yǎng)細胞時,細胞分離后的存活情況，用0.4%臺盼藍直接染色5-10分鐘，在顯微鏡下觀察即可，活細胞不被染色。方便易用，因此在實驗室中比較常用，尤其在心肌細胞原代培養(yǎng)中。
細胞培養(yǎng)要注意這22點！
1.細胞培養(yǎng)前的準備
在開始細胞培養(yǎng)之前，先檢查一下移液管和瓶子的數(shù)量是否充足，以免在開始實驗后再次出入操作臺，這樣可以降低細胞污染的風險。
細胞培養(yǎng)基也應先預熱，選擇只預熱部分培養(yǎng)基而非整瓶加熱，不但可以節(jié)約實驗時間，而且可以避免因反復加熱培養(yǎng)基而造成的蛋白質降解。
結束操作后，需盡可能避光保存。
2.細胞培養(yǎng)的定期檢查
定期檢查培養(yǎng)細胞的形態(tài)，即形狀和外觀，對于細胞培養(yǎng)實驗取得成功至關重要。
除確認細胞的健康狀態(tài)外，每次操作細胞時通過肉眼和顯微鏡檢查細胞還可早期發(fā)現(xiàn)污染征象，避免污染擴散至實驗室其他細胞。
3.細胞變質的征象
細胞變質的征象包括核周出現(xiàn)顆粒、細胞與基質解離以及細胞質空泡形成。
這些變質征象可能為多種原因所致，例如：培養(yǎng)物污染、細胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基。
變質嚴重時將會成為不可逆的變化。
4.細胞培養(yǎng)通風櫥的消毒及布局
�、俦３旨毎囵B(yǎng)通風櫥內的整潔有序，將所有物品置于直視范圍內。
②向放入通風櫥內的所有物品噴灑70%乙醇，擦拭清潔進行消毒。
③在通風櫥中部開闊處放置細胞培養(yǎng)容器；移液器置于右前方易于取用；試劑和培養(yǎng)基置于右后方便于吸��；試管架置于中后部；小型容器置于左后部用于盛放廢液。
5.培養(yǎng)瓶/皿等物品的無菌操作
無菌培養(yǎng)瓶、試劑瓶、培養(yǎng)皿等物品使用時方可揭開蓋子，不得將其開放暴露于環(huán)境中，操作完成后盡快蓋上蓋子，取下蓋子時應將蓋子開口朝下放在工作臺面上。
進行無菌操作時不要說話、唱歌或吹口哨。盡快完成實驗，以盡量避免污染。
6.細胞培養(yǎng)中可能的污染物
細胞培養(yǎng)污染物主要分為兩類：
�、倩瘜W污染物,如培養(yǎng)基、血清和水中的雜質、內毒素、增塑劑和去污劑。
�、谏镂廴疚铮缂毦�、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細胞系的交叉污染。
可通過充分了解污染源以及采用良好的無菌技術，降低污染發(fā)生的頻率和嚴重程度。
7.交叉污染的確認
交叉污染雖不如微生物污染普遍，但與HELA細胞及其他生長迅速的細胞系間廣泛的交叉污染是個明確的問題，會造成嚴重后果。
從聲譽好的細胞庫獲取細胞系、定期檢查細胞系性質及采用良好的無菌技術有助于避免交叉污染。
通過DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可確認有無交叉污染。
8.細胞換液注意事項
為細胞換液時，要沿著培養(yǎng)瓶的一側輕輕地加入，而不是直接加到細胞中，以免損傷細胞，當培養(yǎng)的細胞株較為脆弱時尤其需要注意。
使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體時，每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。
9.細胞傳代的時間把握
當細胞呈指數(shù)增殖，貼壁培養(yǎng)的細胞已占據(jù)所有可用基質、沒有擴增空間，或懸浮培養(yǎng)的細胞已超過培養(yǎng)基質所支撐的能力，無法進一步生長時，細胞增殖速度將大大降低甚至完全停止。
為了將細胞密度維持在最佳水平，以便細胞繼續(xù)生長，并且刺激進一步增殖，必須對細胞進行傳代。
10.細胞培養(yǎng)中使用抗生素的注意事項
細胞培養(yǎng)時不應長期使用抗生素，因為連續(xù)使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產生，導致輕度污染持續(xù)存在。抗生素只能作為對付污染的最后手段短期使用，并盡快撤除。
如果長期使用抗生素，則應同時進行無抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對照。
11.細胞凍存的必要性
連續(xù)培養(yǎng)的細胞系容易發(fā)生遺傳漂變，有限細胞系最終會發(fā)生衰老，所有培養(yǎng)的細胞都易受到微生物污染，即使運轉情況最好的實驗室也會遇到設備故障的問題。
由于已建立的細胞系是一種寶貴資源，更換細胞系成本高昂，而且耗費時間，因此，必須將其冷凍起來，長期保存。
12.細胞凍存的事項
應在細胞濃度高的情況下進行細胞培養(yǎng)凍存，并且細胞傳代的次數(shù)盡可能少。
在凍存前確保活細胞的百分比至少為90%。
請注意，最佳凍存條件取決于所用細胞系。
凍存和復蘇過程對大多數(shù)細胞都會造成不利影響，因此不要通過渦旋震蕩或者用力敲打培養(yǎng)瓶的方法使細胞脫落（培養(yǎng)昆蟲細胞時除外），也不要高速離心細胞。
13.凍存培養(yǎng)基的選擇
凍存細胞時必須選擇凍存培養(yǎng)基，凍存培養(yǎng)基中應含有DMSO或者甘油等冷凍保護劑。還可使用專門配制的完全凍存培養(yǎng)基，例如HyClone、Gibco的細胞凍存培養(yǎng)基。
14.細胞培養(yǎng)溫度的設定
細胞培養(yǎng)的最佳溫度主要取決于細胞供體的體溫，此外也受到解刨部位體溫差異的影響，例如：皮膚溫度低于骨骼肌的溫度。
與溫度過低相比，細胞培養(yǎng)時溫度過高時更為嚴重的問題：因此，往往將培養(yǎng)箱的溫度設定為略低于最佳溫度。
15.各類細胞培養(yǎng)的最佳溫度
大多數(shù)人和哺乳動物細胞系在36℃~37℃下具有最佳生長狀態(tài)。昆蟲細胞在27℃具有最佳生長狀態(tài)；在低于27℃以及27至30℃范圍內，細胞生長較慢。溫度超過30℃時，昆蟲細胞活力降低，即使溫度降至27℃，細胞活力也無法恢復。禽類細胞系在38.5℃時具有最佳生長狀態(tài)。雖然此類細胞也可在37℃下培養(yǎng)，但其生長速度會變慢。
來源于冷血動物（例如：兩棲動物、冷水魚）的細胞系可耐受很寬的溫度范圍，為15-26℃。
請注意每種細胞的培養(yǎng)條件均有所不同，偏離某種細胞所需的培養(yǎng)條件會導致細胞表型異常，甚至培養(yǎng)完全失敗。
16.細胞培養(yǎng)的最適pH
大多數(shù)正常的哺乳動物細胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長良好，而且不同細胞株間差異極小。
但是，目前發(fā)現(xiàn)有些轉化細胞系在輕度偏酸性的環(huán)境中即pH7.0-7.4時生長較好，而有些正常的成纖維細胞系更適合輕度偏堿性的環(huán)境即pH為7.4-7.7。
Sf9和Sf21等昆蟲細胞系最適合在pH值為6.2的環(huán)境中生長。
17.細胞培養(yǎng)基最適pH的控制
細胞培養(yǎng)基可控制培養(yǎng)體系的pH值，為培養(yǎng)的細胞緩沖pH值的變化。
這種緩沖作用通常是通過添加有機緩沖鹽（例如：HEPES）或者二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽實現(xiàn)。
由于培養(yǎng)基的pH值取決于溶解態(tài)二氧化碳與碳酸氫鹽間的精密平衡，因此空氣中二氧化碳含量的變化會改變培養(yǎng)基的pH值。
為此，使用二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽培養(yǎng)基時必須使用外源性二氧化碳，特別是使用開放式培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞或者進行高濃度的轉化細胞系培養(yǎng)時。
18.細胞培養(yǎng)中血清的保存
細胞培養(yǎng)中所用的血清不盡相同，您需要根據(jù)您所培養(yǎng)的細胞種類和培養(yǎng)要求來挑選出最適合的血清。建議將血清保存在-10至-20℃，若存放于4℃，請勿超過一個月。若無法一次用完一瓶，建議將血清無菌分裝至合適體積的滅菌容器內，再放回冷凍箱保存。
解凍血清時，建議將血清從冷凍箱取出后，先置于2-8℃冰箱過夜融解，然后在室溫下使之全融。需要注意的是，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。
19.如何在細胞鋪板時避免“邊緣效應”
細胞實驗鋪板時，為避免“邊緣效應”，以應用96孔板的中間60孔為最佳，一般四周的一圈邊緣孔不養(yǎng)細胞，只做空白或陰性對照。
鋪板時，細胞懸液一定要混勻，以避免細胞沉淀下來而導致每孔中的細胞數(shù)量不等，可以每接幾個就再混勻一下。
加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。此外，吹散次數(shù)過多也會影響細胞活力。所以要熟練操作，盡快上板。
20.何時選擇使用熱滅活血清
加熱血清可以滅活補體系統(tǒng)。
啟動的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，啟動淋巴細胞和巨噬細胞活化。在免疫學研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。
21.熱滅活血清可能出現(xiàn)的現(xiàn)象
在免疫學研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。
而對于其他大多數(shù)的細胞來說是不需要熱滅活血清的。
熱滅活血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至可能因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低；經過熱處理的血清，沉淀物會顯著地增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37度環(huán)境中，又會使此沉淀物增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。
可以根據(jù)您的研究需要選擇是否需要熱滅活血清。如此一來，不但能確保血清的質量，而且能夠節(jié)省時間。
22.如何正確熱滅活血清
熱滅活時請將血清置于56℃水浴30分鐘。
為盡量減少熱滅活對血清品質的影響，一次滅活的血清體積不宜過大。
最好準備同樣的容器裝相等體積的水（與血清相同溫度），滅活時將裝有血清和水的容器同時放入56℃水浴，在裝水的容器中放置溫度計，加熱過程中不時地輕輕旋轉混勻血清，當溫度計顯示達到56℃左右，開始計時。
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