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時間:2022-11-26 01:33:41 注意事項 我要投稿

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  1.報告基因檢測受多種因素影響(載體狀態(tài)、細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率、加樣精度、檢測過程等),因此同批次樣品檢測值也可能出現(xiàn)浮動。所以實驗一般需要做3個或3個以上復(fù)孔,并且引入另一個報告基因作為內(nèi)參。

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灥囊恍┯绊懸蛩丶白⒁馐马?/></p><p>  2.細(xì)胞培養(yǎng)時間不宜過長,12-36h內(nèi)最好;長時間培養(yǎng)后,細(xì)胞難裂解。</p><p>  3.雙熒光素酶報告基因的載體選擇:</p><p>  a)螢火蟲熒光素酶建議選取pGL-3或pGL-4的載體或自己構(gòu)建相應(yīng)的載體;</p><p>  b)海腎熒光素酶建議選取phRL-TK或pGL-4代載體或自己構(gòu)建相應(yīng)的載體。建議海腎載體不使用強(qiáng)啟動子(如SV40、CMV),而選用中等強(qiáng)度的啟動子(如TK)。</p><p>  4.雙熒光素酶報告基因的載體比例:根據(jù)實驗具體情況調(diào)整。建議作一個預(yù)實驗來調(diào)整(螢火蟲載體與海腎載體比例分別用1:10、1:20、1:50、1:100),螢火蟲熒光素酶檢測發(fā)光值大于海腎熒光素酶發(fā)光值的比例較好。</p><p>  5.最適反應(yīng)溫度:室溫(20-22℃)。各個組分(細(xì)胞裂解產(chǎn)物,底物工作液等)都需要調(diào)整到室溫。</p><p>  6.雙熒光素酶反應(yīng)體積:20ul(細(xì)胞裂解產(chǎn)物)-100ul(螢火蟲熒光素酶底物)-100ul(海腎熒光素酶底物),底物量可根據(jù)實際情況調(diào)整,但一定要保證底物過量,不然會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)大的偏差</p><p>  7.細(xì)胞裂解產(chǎn)物存放:常溫不超過6小時;-20℃一個月;-80℃半年</p><p>  8.裂解產(chǎn)物與底物混合(手動加樣):要求混合快速、混合時間一致,避免熒光素酶衰變的影響。</p><p>  9.發(fā)光半衰期:</p><p>  a)單熒光素酶檢測試劑盒(E1500),螢火蟲熒光素酶的發(fā)光半衰期約12min</p><p>  b)雙熒光素酶檢測試劑盒(E1910),螢火蟲熒光素酶的發(fā)光半衰期約9min,海腎熒光素酶的發(fā)光半衰期約2min</p><p>  10.檢測結(jié)果</p><p>  檢測前應(yīng)檢測孔板或空管的發(fā)光值,作為儀器發(fā)光背景值,Modulus多功能檢測儀的儀器背景值應(yīng)小于100;</p><p>  樣品檢測發(fā)光值應(yīng)該遠(yuǎn)大于儀器背景值,例如10000。如果樣品發(fā)光值過于接近儀器背景值,說明樣品中熒光素酶過少,需要考慮轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率等因素。</p>
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