蛋白質(zhì)

　　3、“分子運輸車”——載體

　�。�1）載體具備的條件：

　�、倌茉谑荏w細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。

　　②具有一至多個限制酶切點，供外源DNA的片段插入。

　　③具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。

　�。�2）最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種裸露的`、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細(xì)菌染色體之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。

　�。�3）其它載體：λ噬菌體的衍生物、動植物病毒。

　　基因工程的基本操作程序

　　第一步：目的基因的獲取

　　1、目的基因是指：編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。

　　2、原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。

　　3、PCR技術(shù)擴增目的基因

　　（1）PCR的含義：是一項在生物體外復(fù)制特定DNA的片段的核酸合成技術(shù)。

　　（2）目的：獲取大量的目的基因

　�。�3）原理：DNA雙鏈復(fù)制

　　（4）過程：

　　第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈為單鏈；

　　第二步：冷卻到55～60℃，引物與兩條單鏈DNA結(jié)合；

　　第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始進行互補鏈的合成。

　�。�5）特點：指數(shù)（2n）形式擴增

　　第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）

　　1。目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。

　　2。組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因

　�。�1）啟動子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA的片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。

　　（2）終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA的片段，位于基因的尾端。

　　（3）標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。

　　第三步：將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞

　　1、轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。

　　2、常用的轉(zhuǎn)化方法：

　　將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞：采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，其次還有基因槍法和花粉管通道法等。

　　將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞：最常用的方法是顯微注射技術(shù)。方法的受體細(xì)胞多是受精卵。

　　將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞：原核生物作為受體細(xì)胞的原因是繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少，最常用的原核細(xì)胞是大腸桿菌，其轉(zhuǎn)化方法是：

　　先用Ca2+處理細(xì)胞，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，再將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程。

　　3、重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)。

　　第四步：目的基因的檢測和表達(dá)

　　1、首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交（DNA—DNA）技術(shù)。

　　2、其次還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是采用分子雜交（DNA—RNA）技術(shù)。

　　3、最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是采用抗原—抗體雜交技術(shù)。

　　4、有時還需進行個體生物學(xué)水平的鑒定。如生物抗蟲或抗病的鑒定等。

　　高中選修一生物知識

　　DNA的粗提取與鑒定

　　提取DNA的溶解性原理包括DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。

　　DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度的特點：在0.14mol/L時溶解度最�。灰�使DNA溶解，需要較高濃度？要使DNA析出，又需要0。14mol/L的濃度？

　　在溶解細(xì)胞中的DNA時，人們通常選用2mol/LNaCl溶液；將DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸餾水，以稀釋NaCl溶液。酒精是一種常用有機溶劑，但DNA卻不能溶于酒精（特別是95%冷卻酒精），但細(xì)胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。

　　從理論上分析，預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運動，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。

　　采用DNA不溶于酒精的原理，可以達(dá)到的目的是：將DNA和蛋白質(zhì)進一步分離。

　　提取DNA還可以利用DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理。利用該原理時，應(yīng)選用蛋白酶，因為酶具有專一性，蛋白酶只水解蛋白質(zhì)而不會對DNA產(chǎn)生影響。溫度值為60～80℃，因為該溫度值蛋白質(zhì)變性沉淀，而DNA不會變性。

　　補充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在80℃以上，如在PCR技術(shù)中DNA變性溫度在95℃。

　　當(dāng)鑒定提取出的物質(zhì)是否是DNA時，需要使用什么指示劑進行鑒定？

　　答：在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍(lán)色。

　　原理總結(jié)：通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以從細(xì)胞中提取和提純DNA；再利用酒精進一步將DNA與蛋白質(zhì)分離開來，達(dá)到提純的目的；最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質(zhì)是否是DNA。

　　實驗材料的選取：

　　不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時，應(yīng)本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。

　　本實驗用雞血細(xì)胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細(xì)胞作實驗材料常常需要勻漿和離心，對設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。

　　雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液。

　　破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液。

　　若選用雞血和洋蔥作實驗材料，則怎樣獲取含DNA的濾液？

　　答：在雞血細(xì)胞液中加入一定量蒸餾水并用玻棒攪拌，過濾后收集濾液；切碎洋蔥，加入一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過濾后收集濾液。

　　為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？

　　答：蒸餾水對于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂（細(xì)胞膜和核膜的破裂），從而釋放出DNA。